生化学実験レポート

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おはようございます。

今日は生化学実験のレポートをのせました。

図などが消えているのはご了承ください。

生化学学生実験(第4部)

実験期間 7/3~7/11

  目次
1ページ 概要、目的
1~3ページ 方法
3~9ページ 結果
9ページ 考察、感想
 
概要
 常温と寒冷の2種類の細菌由来のグルコキナーゼ遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて、それぞれの形質転換大腸菌の培養を行い、組み換え酵素の高発現を誘導する。集菌後、発現した組み換え酵素を回収し、さらに塩析、透析法、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、イオン交換クロマトグラフィーを駆使し、酵素の高純度精製を行い、酵素活性やその温度依存性などから酵素の働く仕組みや、どのような細菌由来のGKであるかについて考える。

   目的
 グルコキナーゼの酵素活性について調べ考察すること。

方法
  1日目
 前培養液10 mLをすべてバッフル付き三角フラスコへクリーンベンチ内で移し、120rpm、37℃で振とう培養した。約2時間後、濁度を測定した(OD₆₆₀)。適宜濁度を測定し、OD₆₆₀=0.6以上になったら、培地を氷上で20℃になるまで冷やした。その後、1M IPTGストック溶液を200 µL加え、140rpm、20℃で一晩振とう培養した。振とう培養や濁度測定は分子生命科学分野の研究室のものを使用した。

 空き時間でA buffer(20 mM Tris-Cl,pH7.6,10 mM MgCl₂)を各班1L作成した。

   2日目
 培養液200 mLを2グループで100 mLずつ分けた。分け方は1グループに一つずつ50 mLのファルコンチューブを渡すので、遠心分離機で操作できるように天秤で正確にバランスを取りながら、1回あたりの体積が30 mL強になるように分注した。遠心分離を5,000rpm、4℃で15分間行い、大腸菌をペレットにして集める。上清をフラスコに除き、培養液がなくなるまでこの集菌操作を繰り返した。
 集菌終了後、菌体を洗うためにA bufferを25 mL程度加え、懸濁後バランスを取り、遠心分離を5000rpm、4℃で15分間行う。
 遠心分離後、上清をフラスコに除き、菌体をA buffer10mLに懸濁し、100mMジチオスレイトール150µL、0.2Mフッ化フェニルメチルスルホニル100µLを加え、静かに攪拌し、氷上で20分間放置した。さらに2%デオキシコール酸ナトリウムを1mL加えて攪拌し、-80℃で保存した。-80℃ディープフリーザーは分子生命科学分野の研究室のものを使用した。

   3日目
 前日に-80℃で冷凍したファルコンチューブを氷上で解凍した。解凍後、ストレプトマイシンを終濃度2%になるように添加し、確実に溶けるまで攪拌した後、遠心分離を5000rpm、4℃で20分間行った。遠心分離後、沈殿と上清がまざらないように静かに上清画分と沈殿画分に分けた。ここで得られた上清画分を上清➀とし、次項の硫安画分へ用いた。
 菌破砕によって得られた上清①の体積を測り、適当なビーカーに移し、硫酸アンモニウムを奇数班30%飽和、偶数班は40%飽和になるように加えた。硫安画分に使用した硫安はメノウ乳鉢よくすりつぶしておいた。20分間スターラーで攪拌したのち、遠心分離を5000rpm、4℃で20分間行った。この操作の後、得られた沈殿を沈殿②、上清を上清②とした。上清②の体積を測り、硫安を奇数班は50%、偶数班は60%飽和になるように加え、上記と同様に攪拌し、遠心分離を行った。ここで得られた沈殿を沈殿③、上清を上清③とした。最後に上清③の体積を測り、硫安を80%飽和になるように加え、上記と同様に攪拌し、遠心分離を行った。ここで得られた沈殿を沈殿④とした。上清にはほとんどタンパク質は含まれていないはずなので、捨てた。

   4日目
  サンプルの調製
 80%飽和硫安A bufferで懸濁した沈殿⑤~⑦を遠心後、沈殿を除かないように上清をある程度除いた後、キムワイプなどで作成したこよりなどで作成したこよりなどで注意深く上清を除き、沈殿にサンプルバッファー20µLを加えてよく混合した。
 その他のSDS-PAGE用サンプル10µLとサンプルバッファー10µLをエッペンドルフチューブに混ぜて、すべてのサンプルを100℃で3分加熱した。
  電気泳動
 ・泳動槽の白金電極あたりまでSol.Eを注いだ。
 ・ゲル板のクリップ、ゴムパッキンを外して泳動槽にセットした。
 ・内側にSol.Eを満杯に注ぎ、慎重にコームを外した。
 ・先が長いチップでマーカー及びサンプルでアプライした。
 ・Stacking gelを通過するまでは、60Vの電圧をかけて泳動した。Separation gelに入ったら、電圧を120Vにあげてゲルの下部まで泳動した。

   5日目
  カラムの平衡化
 HiTrapQ FFカラムの上部のネジキャップを外した。フィルターした超純水をシリンジに10 mLほど入れ、シリンジ先端の空気を追い出し、気泡が出てこない状態を作った。カラムを垂直に立て、上部の穴にゆっくりシリンジからポタポタと数滴垂らすと、水面張力で穴上が液体で盛り上がった。この状態でシリンジ先端をカラム上部に取り付けた。この後、カラム下部のキャップを外した。1mL/minぐらいになるスピード5mLの超純水を流した。早すぎると目的タンパク質が出てこないことやカラム最大圧力超過により破損することが考えられるので、できる限りこのスピードを心がけること。
 次に、カラム下部のキャップを取り付け、カラム上部のシリンジをゆっくり外した。このときカラム下部のキャップを取り付け忘れると、カラム下部から空気が流入するので注意した。フィルターしたA bufferを10mLほどシリンジに取り、先ほどと同様に気泡が出ないように、カラム上部へポタポタと溶液を垂らしてから、シリンジを取りつけカラム下部のキャップを外してから、1mL/minの流速で5mLを流した。これでカラムの平衡化が完成した。

   6日目
  室温での酵素活性
➀反応液➀を1.5mLエッペン15本に290µLずつ分注した。
②ブランク用の3本には50%トリクロロ酢酸を15µL入れた。
➂酵素活性用、ブランク測定用のそれぞれに1倍希釈、10倍希釈、100倍希釈したGKを10µL×2ずつ加え、直ちに混合し反応を開始させた。
④酵素活性用の6本にGKを加えてから5分後に50%TCAを15µL加えて反応をとめた。
⑤すべてのエッペンに2Mtrisを30µL加えて中和させ、十分に混合させた。
⑥反応液②をプレートの底面に傷のついていない15か所へ150µLを分注させた。
⑦反応液②を分注したすべてのセルに反応液➀を172.5µL加え、よく混合した。

  結果
下記に示す表は以下の手順で求めた。
ΔA /min=(測定値-ブランク)÷5min
初速度(V₀)=(ΔA/min)÷ε(NADPH)×322.5/172.5×345/300 ※ε(NADPH)=6.22
初速度=mmol/mL=µmol/mL=U/mL
Mg/mL=【GK】×35kDa×10÷1000 ※【GK】=0.00776mM
U/mg=U/mL÷㎎/mL×希釈倍率

 7班:好冷、速度論的解析
計算方法

基質濃度 1 mM
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mg
1 2.312 0.102 0.442 0.153 0.1528 0.6524 0.234
10 1.492 0.102 0.278 0.096 0.0096 6.524 0.001
100 0.305 0.16 0.029 0.01 0.0001 65.24 2E-06

基質濃度 0.5 mM
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mg
1 1.367 0.102 0.253 0.087 0.0875 0.6524 0.134
10 0.931 0.102 0.1658 0.057 0.0057 6.524 9E-04
100 0.223 0.16 0.0126 0.004 4E-05 65.24 7E-07

基質濃度 0.25 mM
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mg
1 0.77 0.102 0.1336 0.046 0.0462 0.6524 0.071
10 0.745 0.102 0.1286 0.044 0.0044 6.524 7E-04
100 0.197 0.16 0.0074 0.003 3E-05 65.24 4E-07

基質濃度 0.17 mM
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mg
1 0.581 0.102 0.0958 0.033 0.0331 0.6524 0.051
10 0.57 0.102 0.0936 0.032 0.0032 6.524 5E-04
100 0.192 0.16 0.0064 0.002 2E-05 65.24 3E-07

NADPHのεmM
6.22
酵素反応時間min
5
希釈倍率
2.15
酵素(溶出④+5倍希釈入り)の吸光度
0.466
GKのε
25
GKの分子量
35000
GKのmg/mL
0.6524
吸光度
基質(グルコース)濃度
1 0.5 0.25 0.17 0
酵素濃度 ×1 2.312 1.367 0.77 0.581 0.102
×10 1.492 0.931 0.745 0.57 0.102
×100 0.305 0.223 0.197 0.192 0.16


吸光度-ブランク
基質濃度
1 0.5 0.25 0.17 0
酵素濃度 ×1 2.21 1.265 0.668 0.479 0
×10 1.39 0.829 0.643 0.468 0
×100 0.145 0.063 0.037 0.032 0

ΔA/min(吸光度-ブランク ÷ 酵素反応時間)
基質濃度
1 0.5 0.25 0.17 0
酵素濃度 ×1 0.442 0.253 0.134 0.096 0
×10 0.278 0.1658 0.129 0.094 0
×100 0.029 0.0126 0.007 0.006 0


初速度(ΔA/min ÷ εNADPH × 希釈倍率)
基質濃度
1 0.5 0.25 0.17 0
酵素濃度 ×1 0.15278135 0.08745177 0.046 0.033 0
×10 0.09609325 0.05731029 0.044 0.032 0
×100 0.01002412 0.00435531 0.003 0.002 0


1/初速度(ミカエリス・メンテン式代入用)
1/基質濃度
1 2 4 5.882
酵素濃度 ×1 6.54530148 11.4348745 21.65 30.2
×10 10.4065585 17.4488737 22.5 30.91
×100 99.7594226 229.60502 390.9 452

近似式 y切片 V0(最大酵素反応速度) x切片 Km(ミカエリス・メンテン定数)
y = 4.8725x + 1.7659 1.766 0.566283482 -0.36 2.759216264

近似式 y切片 V0(最大酵素反応速度) x切片 Km(ミカエリス・メンテン定数)
y = 3.9252x + 7.6735 7.674 0.130318629 -1.95 0.511526683





近似式 y切片 V0(最大酵素反応速度) x切片 Km(ミカエリス・メンテン定数)
y = 71.29x + 63.49 63.49 0.015750512 -0.89 1.122853993
 1班:好冷、比活性と温度依存性
1班・非活性と温度依存症
室温 希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mg ㎎/mL U/mg
1 1.873 0.104 0.3735 0.122 1.22 3.542 0.345
10 0.469 0.101 0.0735 0.025 2.54 3.542 0.717
100 0.151 0.103 0.0095 0.003 3.28 3.542 0.927

氷上 希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mg
1 1.873 0.104 0.174 0.06 0.6 3.542 0.17
10 0.197 0.101 0.0191 0.007 0.66 3.542 0.186
100 0.105 0.143 0.0004 1E-04 0.14 3.542 0.039
 8班:中温、速度論的解析
反応液1
希釈倍率 測定値 ブランク △A/min 初速度 U/mL ㎎/mL U/mg
10 0.094 0.091 0.0006 4.487E-05 1E-04 0.385 4E-04
100 0.322 0.09 0.0464 0.0034697 0.012 0.0385 0.3
1000 0.107 0.086 0.0042 0.0003141 0.001 0.0039 0.272
反応液2
希釈倍率 測定値 ブランク △A/min 初速度 U/mL ㎎/mL U/mg
10 0.606 0.091 0.103 0.0077021 0.026 0.385 0.067
100 0.226 0.09 0.0272 0.0020339 0.007 0.0385 0.176
1000 0.094 0.086 0.0016 0.0001196 4E-04 0.0039 0.104
反応液3
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mg
10 0.695 0.091 0.1208 0.009 0.03 0.385 0.078
100 0.228 0.09 0.0276 0.002 0.007 0.0385 0.179
1000 0.094 0.086 0.0016 1E-04 4E-04 0.0039 0.104
反応液4
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mg
10 0.501 0.091 0.082 0.006 0.02 0.385 0.053
100 0.209 0.09 0.0238 0.002 0.006 0.0385 0.154
1000 0.096 0.086 0.002 1E-04 5E-04 0.0039 0.129
6班:中温、速度論的解析
中温
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mL
10 2.308 0.164 0.4287 0.148184 0.148184 0.107683 1.37611
100 0.922 0.097 0.1649 0.056999 0.056999 0.043003 1.32546
1000 0.14 0.093 0.0093 0.003215 0.003215 0.00651 0.493799
氷上
希釈倍率 測定値 ブランク ΔA/min 初速度 U/mL mg/mL U/mL
10 2.232 0.164 0.4135 0.14293 0.14293 0.104137 1.372524
100 0.04 0.097 0.0612 0.021154 0.021154 0.018807 1.124832
1000 0.108 0.093 0.0029 0.001002 0.001002 0.005017 0.199816

  考察
 1班と6班の表を比較すると、常温では6班の方が反応速度が速く、氷上では1班の方が反応速度が速くなった。つまり、常温由来の細菌が6班で、氷温由来の細菌が1班であるということが分かった。また、基質濃度が大きくなるにつれて反応速度が大きくなることも分かった。

  感想
 今回の実験は正直最初から最後まで何をしているのかよくわからなかった。もっと内容、原理等を明確に記していただきたかった。