目的
無菌操作の手技を身につけ、正しく操作することを目的とした。
方法
酵母の実験
酵母用培地の調製
・スラント、棒状培地に使うPDA培地と液状培地に使う麦芽エキス培地を作った。
・PDA培地はPDA31.2 g、寒天4.0 g、脱イオン水800 mLを1L容三角フラスコに加え、アルミホイルでフタをし、湯煎して寒天を十分に溶かした。そして、溶かした液をスラント(6 mL):40本、棒状(12 mL):45本に分柱した。スラントは斜めにして固めた。
・麦芽エキス培地は麦芽エキス3.0 g、グルコース3.087 g、ぺプトン 0.158 g、脱イオン水150 mLを300 mL容ビーカーに加え溶かし、液状(10 mL):12本に分柱した。
酵母の接種
〈使用酵母〉
・Saccharomyces cerevisiae
・Schizosaccaromyces octosporus
・Hansenula anomala
・Rhodotorula glutinis
・Sporobolomyces salmonicolor<操作手順>
・クリーンベンチのファンスイッチと照明スイッチをONにした。
・衣類の袖をまくり、手と腕をオスバン液に浸した布で拭いた。
・試験管のガラス部や白金耳の柄の部分をオスバン液で浸した布で拭いてもらい、クリーンベンチで入れてもらった。
・白金耳などのニクロム線部分を火炎で熱し、冷ましてから菌を接種した。
・作業が終了したらファンスイッチをOFFにした。
酵母の純粋培養
平板注加培養法
・クリーンベンチ内を殺菌した。
・寒天培地を100℃のお湯で溶解した。
・溶けた寒天培地を55℃の湯煎に入れ、この温度に保った。
・滅菌済みシャーレの新聞紙を破り、シャーレをクリーンベンチ内に入れた。
・種菌、滅菌水、白金耳3本をクリーンベンチ内に入れた。
・種菌から1白金耳とり、滅菌水に浸し、攪拌した(第一希釈液)
・溶けた寒天培地を2本クリーンベンチ内に入れた。
・第一希釈液より1白金耳とり(白金耳は一回ごとに変えた)第一の培地に懸濁した(第2希釈)
※両手の手のひらに試験管を挟んで錐もみすると泡立たなかった。
・これより1白金耳とり、第2の培地に懸濁した。(第3希釈液)
・第1、第2の培地をそれぞれシャーレに流し込みフタをした。
・素早く寒天培地を均一に広げた。
・寒天が凝固したらクリーンベンチから取り出し、倒置して30℃のインキュベーターで培養した。
※素早く操作しないと途中で寒天が固まり失敗した。
Sporobolomycesの胞子射出
・同大のシャーレ(フタとフタ、実と実)を合わせ一人一つ乾熱滅菌し、それぞれに寒天培地を流し込んだ。
・第1のシャーレに種菌(スラント)から1白金耳をとり、字を書くように接種した。
・2つのシャーレを合わせ、テープで止め、30℃で培養した。(第1シャーレが上)放出された胞子は第2のシャーレ上に落ち、増殖してコロニーを形成した。
・saccharomycesも同様に班で2つ行った。
結果
<肉眼観察>
・学名 Saccharomyces cerevisiae
・培養温度 30℃
・日数 1日目
・培地 PDA培地 麦芽エキス培地
(ⅰ)斜面培養 (ⅱ)穿刺培養 (ⅲ)液体培養
・発育旺盛 ・上、中部に発育 ・少量の沈殿あり
・白色 ・漏斗型 ・粒状
・湿り気有 ・表面も発育している ・白色
・光沢艶あり
学名 Schizosaccharomyces octosporus
・培養温度 30℃
・日数 1日目
・培地 PDA培地 麦芽エキス培地
(ⅰ)斜面培養 (ⅱ)穿刺培養 (ⅲ)液体培養
・発育旺盛 ・発育場所上部 ・白濁、沈殿あり
・表面平滑 ・表面発育なし ・表面発育なし
・白色不透明 ・発育少 ・ガス発生なし
・光沢艶あり ・粘り気なし
学名 Hansenula anomala
・培養温度 30℃
・日数 1日目
・培地 PDA培地 麦芽エキス培地
(ⅰ)斜面培養 (ⅱ)穿刺培養 (ⅲ)液体培養
・発育旺盛 ・発育場所上部 ・白濁、沈殿あり
・表面平滑 ・表面発育少 ・表面発育なし
・白色不透明 ・発育少 ・ガス発生なし
・光沢あり ・粘り気なし
学名 Rhodotorula glutinis
・培養温度 30℃
・日数 1日目
・培地 PDA培地 麦芽エキス培地
(ⅰ)斜面培養 (ⅱ)穿刺培養 (ⅲ)液体培養
・発育旺盛 ・発育場所上部 ・少量の沈殿あり
・表面粗、湿り気有 ・折れ曲がっている ・サーモンピンク
・サーモンピンク ・表面発育有 ・表面発育なし
・光沢艶あり ・ガス発生なし
学名 Sporobolomyces salmonicolor
・培養温度 30℃
・日数 1日目
・培地 PDA培地 麦芽エキス培地
(ⅰ)斜面培養 (ⅱ)穿刺培養 (ⅲ)液体培養
・発育旺盛 ・発育上部 ・ピンクの沈殿
・ピンク ・ピンク ・発育度中
・艶光沢有 ・発育度中 ・表面発育なし
平板注加培養
希釈度高 希釈低
コロニー数
3120個 480個
胞子射出
考察
濃度の違う2つの菌液ではコロニーの大きさと数に大きな違いが生じた。その理由として、濃度が大きい方がより多くの菌を有するため、大きさが大きくなり、数も多くなると考えた。また、レポート課題として平板注加培養で凝固した寒天を倒置するのはなぜかという問いがあった。これは寒天が下にあると上の蓋の水滴が寒天に落ちるのは防ぐためだと考えられる。
カビの実験
方法
菌の接種
・白金鈎を使用し、胞子のみをとった。
・胞子を着生していないものは菌糸をごく少量かきとった。
・胞子が飛散するのでクリーンベンチは1種ごとに殺菌しなおした。
〈液体培養〉
・クリーンベンチ内で2本の300 mL容三角フラスコに麦芽エキス培地を30 mL流し込んだ。
・白金鈎で種菌から胞子をとり、液体培地に接種した。
・30℃で静置培養と振とう培養を行った。
〈スラント培養〉
・PDA培地の斜面培地に種菌から白金鈎で接種した。
〈スライド培養〉
・寒天培地を寒天の厚さが0.5-1 mmとなるように注いだ。
・滅菌したスパーテルの後ろの部分で線を引き6-10 mm平方の寒天フィルムを切り出した。
・滅菌したスライドグラスへ寒天フィルムをのせた。
・寒天フィルムの側面(4面)に胞子をつけた。
・滅菌したカバーガラスをのせた。
・3方ワセリンで封じた。
・シャーレの中に水を湿らせたろ紙をひき、その上にマッチ棒を枕にしてスライドグラスを置く。
・シャーレの蓋をして30℃で培養した。
・スライドグラスを顕微鏡にのせ10~100倍で観察した。
結果
菌名 Aspergillus oryzae Aspergillus luchuensis Penicillium chrysogenum Rhizopus javanicus Mucor javanicus Monascus anka
日数 1日 1日 1日 1日 1日 1日
培養法 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養
スケッチ
所見 ・白色
・発達旺盛
・粒状
・くもり有 ・白色
・発達度中
・粒状
・くもり中
・気菌糸有 ・薄い黄色
・発達少
・密集 ・発達少
・白い粒々 ・薄い黄色
・発達度中 ・赤
・発達少
・厚みなし
日数 1日 1日 1日 1日 1日 1日
培養法 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養
スケッチ
所見 ・黄土色
・気菌糸なし
・粒々 ・薄黄色
・発達旺盛
・気菌糸なし ・密集有
・もわっとしていた
・発育少
・クリーム色
・気菌糸なし ・茶色
・発育少
・厚みなし
・気菌糸なし ・クリーム色
・もわっとしていた
・密集有
・気菌糸なし ・密集有
・白
・気菌糸少
日数 1日 1日 1日 1日 1日 1日
培養法 スラント培養 スラント培養 スラント培養 スラント培養 スラント培養 スラント培養
スケッチ
所見 ・気菌糸発達中
・白色
・密集有
・くもり有
・発達中 ・気菌糸発達旺盛
・白色~薄黄色
・くもり有
・全体に広く発達 ・気菌糸発達少
・白色
・疎
・くもりなし
・発達遅い ・気菌糸発達旺盛
・くもり有
・発達早い
・全体に広く発達 ・気菌糸発達旺盛
・くもり有
・発達早い
・糸が盛りあがっていた
・白色 ・気菌糸発達極少
・赤色
・くもり有
・発達遅い
日数 1日 1日 1日 1日 1日 1日
培養法 スライド培養 スライド培養 スライド培養 スライド培養 スライド培養 スライド培養
スケッチ
所見 10×40倍
薄緑 10×40倍
緑 10×40倍
クリーム色 10×40倍
濃い緑 10×40倍
薄い緑 10×10倍
深緑
日数 2日 2日 2日 2日 2日 2日
培養法 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養 液体静止培養
スケッチ
所見 ・黄緑
・もわもわしていた
・気菌糸発達中
・発育旺盛
・密集、菌蓋有 ・密集
・こげ茶
・表面でこぼこ
・盛りあがり、菌蓋有
・発育旺盛 ・発育中
・密集有
・深緑
・濁っていた
・気菌糸少
・深緑
・気菌糸少
・密集有
・もわもわ ・ベージュ
・気菌糸なし
・密集有
・もわもわ ・ちょっと赤とクリーム色
・気菌糸なし
・厚み少
日数 2日 2日 2日 2日 2日 2日
培養法 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養 液体振とう培養
スケッチ
所見 ・白
・丸い粒
・気菌糸なし
・発育度中 ・白
・丸い粒
・気菌糸なし
・発育度中 ・白
・小さい粒
・気菌糸なし
・濁りあり ・クリーム色
・丸い大きな粒
・発育度中
・気菌糸なし ・ベージュ
・大きな塊
・気菌糸なし
・厚みあり ・クリーム色
・一つの中くらいの塊
・気菌糸なし
・厚みあり
日数 2日 2日 2日 2日 2日 2日
培養法 スラント培養 スラント培養 スラント培養 スラント培養 スラント培養 スラント培養
スケッチ
所見 ・抹茶色と白色
・気菌糸大幅に発達
・表面の盛りあがり ・黒色
・気菌糸の発達少
・表面粒々
・発達旺盛
・盛りあがり少 ・白と青緑
・発達少
・気菌糸少
・盛りあがり中
・菌蓋有
・気菌糸発達大
・生育大
・盛りあがり大
・白 ・気菌糸発達度中
・緑茶色
・盛りあがり中 ・オレンジ
・点々
・表面でこぼこ
・気菌糸なし
日数 2日 2日 2日 2日 2日 2日
培養法 スライド培養 スライド培養 スライド培養 スライド培養 スライド培養 スライド培養
スケッチ
所見 10×10倍
緑茶色 10×10倍
黒いもじゃもじゃ 10×40倍
青緑 10×10倍
苔の薄い色 10×10倍
灰色 10×40倍
茶色
考察
カビの培養はコンタミしないように気を付けた甲斐あって、想定通りの結果が得られた。また、今回使ったカビはどういうことに使われているのかという課題について下記に示す。A.oryzaeは米、麦、大豆などの穀物の発酵に利用される。A.luchuensisは酒の製造過程で利用される。P.chrysogenumはチーズの製造に用いられる。R.javanicus,M.javanicusは紹興酒などの酒の製造に用いられる。M.ankaは紅酒や豆腐などの発酵食品に利用されている。
乳酸菌の実験
方法
ヨーグルトの作成
<スキムミルク培地の調製>
・メスシリンダーで脱イオン水を800 mLと500 mL測り、別々の1000 mL容三角フラスコに入れ、液面に印をつけた。
・上記の三角フラスコの800 mLを測った方に、スキムミルク120.0 gと砂糖64.0 gを入れ、500 mL測った方に、スキムミルク50.0 gを入れた。
・それぞれの三角フラスコに脱イオン水を印を付けたところまで加え、50℃ほどのお湯で完全に溶解させた。
・三角フラスコにシリコ栓をし、100℃、30分間で3回の間欠滅菌を行った。
・クリーンベンチ内でスキムミルク培地にそれぞれ乳酸飲料(ジョア)を1本ずつ加えた。
・800 mL調製したスキムミルク培地と乳酸飲料の混合液を乾熱滅菌した100 mL容ビーカーに分柱した。
・500 mLスキムミルク培地と乳酸飲料の混合液と上記のビーカーを37℃でインキュベートした。
乳酸菌の純粋分離
培地:BCP加寒天培地
試料:市販の乳酸菌含有飲料(班で数種類試験した)<二重皿扁平培養法>
・シャーレの実皿をフタ皿の上に重ねて乾熱滅菌した。
・溶かした培地(20 mL)をフタ皿に注いだ。
・寒天が凝固しないうちに実皿の底部をこの上に押し込み37℃で1~2日培養した。
抗生物質の力価検定
検定菌:Bacillis subtilis
使用抗生物質:ストレプトマイシン
力価検定の方法:カップ法
・ブイヨン寒天培地12 mLをシャーレに流し込んで固めた。
・B.subtilis菌液2滴を4 mLの溶かしたブイヨン軟寒天培地に接種し、振とう混和後、下層培地上に流し込んだ。
・ステンレスカップはあらかじめシャーレに入れ乾熱滅菌し、1プレートに4つのカップ上記の重層培地上へ約1 cmの高さから落とすように置いて少し寒天内に突き入らせて立てた。
・2個のカップ内へ10ɤ、40ɤのストレプトマイシン液を数滴入れ、残りの２個のカップに濃度未知のストレプトマイシン液を入れ、37℃で培養後、生育阻止円の直径を測定した。
結果
二重皿扁平培養法でコロニーは検出されなかった。
SH SL UH UL
濃度(µg/mL ) 10 40 X Y
1つ目直径(mm) 11 16 14 12
2つ目直径(mm) 9 16 14 13
3つ目直径(mm) 12 17 17 13
4つ目直径(mm) 8 16 14 13
この結果から、y=0.0175x+0.925という式が出せた。
xとyの平均値をここに代入して計算すると、
x=31.429 y=7.143
よって、xの濃度は31.429ɤ、yの濃度は7.143ɤとなった。
考察
今回使用したxとyの実際の値はそれぞれ30ɤ、20ɤである。xはおおよそ近い値がとれているが、yは大幅にずれている。この原因はいろいろ考えられるが、私は菌接種時と抗生物質の滴下時にコンタミネーションが起こってしまったと考える。
ɤ-アミノ酪酸(GABA)生産性乳酸菌のスクリーニング
分離源:持参
使用培地:MRS液体培地
炭酸カルシウム含有MRS寒天培地
グルタミン酸含有MRS液体培地<1日目>
・持参した分離源をMRS液体培地に接種し、30℃嫌気条件下で培養した。<2日目>
・培地が濁っているのが確認出来たら、培養液を1白金耳とり、炭酸カルシウム含有MRS寒天培地に塗布し、30℃嫌気条件下で培養した。<3日目>
・培養しておいた炭酸カルシウム含有MRS寒天培地を観察し、周囲にクリアゾーンができているコロニーを選択した。
・選択したコロニーを釣菌し、新しいMRS寒天培地2枚に植菌し、最後にグルタミン酸含有MRS液体培地に接種した。
・2枚のMRS寒天培地はナンバリングシートを張っているので、各自、同じ番号の箇所に植菌した。
・寒天培地は1~2日間培養、グルタミン酸含有MRS培地は3~4日間培養した。<4日目>
・植菌した2枚の寒天培地のうち、1枚は保存用で、もう1枚はカタラーゼ試験用にした。
・コロニー上に過酸化水素水を滴下し、様子を観察した。<5日目>
・グルタミン酸含有MRS液体培地で培養していた培養液を1 mLマイクロチューブに採取した。
・遠心分離後、上清500 μlを別のマイクロチューブに採取した。
・このサンプルについて、TLCにより、GABA生産の有無を確認した。
・TLCは2班で1つ使用した。
・また、その際に、下記に示すコントロールもスポットした。
・展開後、乾燥させニンヒドリンによって、発色させた。
➀MRS液体培地
②グルタミン酸含有MRS液体培地
➂GABA含有MRS液体培地
④②+➂
⑤Lactobacillus brevis NBRC 12005(GABA生産菌)の培養液上清展開溶媒(ｎ-ブタノール:酢酸:水=3:2:1)
結果
私が採取した試料からとれたコロニーは過酸化水素水をかけると発泡した。
考察
私の採取した試料のコロニーが発泡したことから、この資料には乳酸菌が含まれていないことが分かった。また、TLCの結果を見ると全員が大体求めていた結果が表れていたので、過程がしっかりできていたと思った。
細菌の実験
<菌の接種>
・Escherichia coliとBachillus subtilisはブイヨン斜面培地に接種し、37℃で培養を行った。
・Lactococcus lactisはMRS高層培地に接種し、30℃で穿刺培養を行った。<細菌の顕微鏡観察>
油浸法
・スライドガラスに滅菌水を1滴滴下した。
・白金耳または白金線で菌を懸濁した。
・軽く火炎固定した。
・カバーグラスに滅菌水を1滴滴下し、反転させてカバーをした。
・カバーグラスの上にセダー油を滴下し、検鏡した。
※油浸用の対物レンズを使用した。
※セダー油は1滴とし、あまり多量滴しなかった。
※使用後は直ちに、レンズクリーニング用のペーパーでレンズに付着したセダー油をふき取った。
グラム染色
・Escherichia coli(グラム陰性)とbacillus subtilis(グラム陽性)を同一スライドグラス上に塗布して行った。
・ポイントはスライドグラス上に菌体を少なめに薄くかつ、広くひろげることと各染色液の水洗を静かに行ったことである。<試薬>
・クリスタルバイオレット液
・ルゴール液
・サフラニン液<染色法>
・乗法通り塗布、風乾、固定した。
・クリスタルバイオレットで1~2分間染色した後、十分傾斜した。
・直ちに水洗後水を切った。
・ルゴール液に1分間浸した。
・水洗後水を切った。
・95%アルコールの中でゆっくり動かし脱色した。この時間が長いとグラム陽性菌も脱色されてしまうので注意した。
・直ちに水洗した。
・サフラニン液で1分間対比染色した。
・水洗、風乾後、カバーグラスに1滴滅菌水を滴下し、かぶせて検鏡した。
・上記の手順で、まずグラム陰性細菌Esherichia coliとグラム陽性細菌Bacillus subtilisのそれぞれに対してグラム染色を行った。その後、Ｅ.coliとB.subtilisを混ぜてグラム染色を行い、染め分けができているか確認した(グラム陽性菌は青色、グラム陰性菌は赤色に染まる)。
・Lactococcus lactisについて、グラム染色を行い、陰性か陽性かを決定した。
結果
菌名 Escherichia coli Bacillus subtilis Lactococcus lactis
培養法 スラント培養 スラント培養 穿刺培養
日数 1日 1日 1日
スケッチ
所見 ・白
・発育少
・光沢有 ・肌色
・一様に広がっていて隆起はあまりしていなかった。
・発育度中 ・白色
・下部まで生育していた。
・発育度中
・白い毛のようなものが飛び出ていた。
日数 2日 2日 2日
スケッチ 変化なし 変化なし 変化なし
所見 変化なし 変化なし 変化なし
培養法 油浸法 油浸法 油浸法
日数 1日 1日 1日
スケッチ
所見 ・グラム陰性 ・グラム陽性 ・グラム陽性
考察
グラム染色の際、私たちの班は想定のものが観察できるまで同じ操作を何度も繰り返した。この理由は最初の方の染色時に火炎固定が十分にできておらず、液が流れてしまったと考えられる。
ファージの実験
使用菌:E.coli B株
T1ファージ、T2ファージ、T3ファージ、T4ファージ、Ｔ5ファージ
培地:ブイヨン培地<プラークカウント法>
・感染力を持つファージの数を測定するため、寒天重層法によるプラークカウントを行った。
・ファージを多量の感受性菌とともに寒天平板培地上に塗布すると、菌の増殖によって平板は一様に濁るが、ファージが存在した箇所のみ溶菌し、透明な部分(プラーク)が現れた。
・このプラークを数えることにより、活性ファージの数を知ることができた。
・1枚の平板で数えうるプラークの数は、プラークの大きさによって異なるが、100~1000が適当であった。
・したがって、ファージ液は適当に希釈して、数段階の希釈液についてプラークカウントを行う必要があった。
・平板上にファージとともに塗布する菌を指示菌と呼び、実験に応じて各種の指示菌を用いるが、ここではE.coli B株を使用した。
準備
・E.coli B株の培養液
菌の濃度はOD₆₆₀=0.3前後が適当であった。
・ファージ液
Ｔ1、Ｔ2、Ｔ3、Ｔ4、Ｔ5
・希釈用の生理食塩水(0.85%)
9.9 mLを2本、4.5 mLを3本
・上層培地分柱用滅菌小試験管8本
・滅菌シャーレ8枚
・この実験で使用したピペット類はあらかじめ滅菌しておいた。
実験
・下層培地を溶かし、シャーレに20 mLずつ流し固めた。
・ファージ液の希釈
ファージ原液を0.1 mLとり、9.9 mLの希釈液に加え混和した(100倍希釈)。もう一度100倍希釈を行い、0.5 mLをとり希釈液4.5 mL加え混和した(10倍希釈)。10倍希釈を3回行った。
・上層培地を溶かし、滅菌小試験管に3 mLずつ分柱し、55℃に保った。
・分柱した3 mLの上層培地に菌液3滴、ファージ液を0.1 mL加え、混和後下層培地上に塗布した。実験は希釈倍率の高いものから行った。
・倒置せずに37℃で一晩培養した。
・プラークをよく観察し、計数した。(ファージによってプラークの様子は異なった)<溶菌実験>
・ファージ感染菌は潜伏期後溶菌を起こした。その経過を分光光度計を用いて追跡すると、溶菌は比濁度の減少として表れた。
『準備』
・ブイヨン液体培地10 mLを滅菌済みL字管に入れる。(各班3本ずつ)
・E.coli B株の培養液
・適宜希釈したファージ液
『実験』
・上記ブイヨン培地3本にE.coli B株を接種した。OD₆₆₀が0.1付近になるように比濁度のコントロールにはブイヨン液体培地を用いた。
・接種したL字管のOD₆₆₀が0.3付近に達したら、ファージ液0.1 mL、100倍希釈ファージ液0.1 mLを2本のL字管に加え、モノー振とう器を使い37℃で培養した。
・ファージを加えたときを０分として、10~15分毎にOD₆₆₀を測定し、その経過をグラフ用紙に記入した。(測定時間はファージの種類で異なった)<溶菌実験>
ファージ感染菌は潜伏期後溶菌を起こした。その経過を分光光度計を用いて追跡すると溶菌は比濁度の減少として表れた。
『準備』
1． ブイヨン液体培地10 mLを滅菌済み試験管に入れた(3本)
2． E.coli B株の培養液
3． 適宜希釈したファージ液
『実験』
1． 上記ブイヨン培地3本にE.coli B株を接種した。OD₆₆₀が0.1付近になるように比濁度のコントロールにはブイヨン液体培地を用いた。
2． 接種した試験管のOD₆₆₀が0.3付近に達したら、ファージ液1.0 mL、100倍希釈ファージ液を2本の試験管に加えモノー振とう器を使い37℃で培養した。
3． ファージを加えたときを0分として、10~15分毎にOD₆₆₀を測定し、その経過をグラフ用紙に記入した。
結果
溶菌実験で使うファージ液の量の計算
10⁶希釈の液を用いて行い、0.1ml中に平均34個のコロニーが検出されたため、以下の結果になった。
34/0.1=340個/ml
ファージ液の原液 340×10⁶個/ml
ここでmoi値は0.5、バクテリアは2.0×10⁸個/mlであるから、
340×10⁶×x/2.0×10⁸×5=0.5
ゆえに、x=1.47
必要なファージ液の量は1.47ｍL
考察
このグラフからファージ液を培養液に加えたものが時間の経過とともに比濁度が下がていることが読み取れる。これはファージが菌を捕らえているためである。また、比濁度が最小値まで下がると今度は徐々に上がるようになる。これは培養液内の菌がファージに対する耐性菌を生成するためである。
遺伝子工学実験
DNAのHindⅢにより消化実験手順
1) マイクロチューブを2本とり、それぞれ(λ)、(P)の印をつけた後チューブ縦にたてた。
2) P-200を用いてそれぞれのチューブにH₂Ｏを28μl分柱した。
3) P-20を用いて、HindⅢ用10倍濃縮緩衝液を青丸チューブから5 μL採りそれぞれのチューブに加えた。
4) λファージDNA(赤丸チューブ)をp-20で15μL採り(λ)のチューブに加え、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。チップは換えた。
5) pUC19DNA(黄丸チューブ)をp-20で15μL採り、(P)のチューブに加え、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。チップは換えた。
6) 制限酵素HindⅢ(白丸チューブ:氷中)をp-20で2 μLt採りそれぞれのチューブに入れ、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。
7) それぞれのチューブは37℃に設定されたドライブロックに突き刺し、10分加温した。
8) それぞれのチューブにH₂Oをp-200を使って300μL(150μLを2回)加えた。
9) p-1000を使ってフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを350μL それぞれのチューブに加えた。フェノールクロロホルムイソアミルアルコールは皮膚につくと重度のやけどをおこすので、取り扱いには十分に注意した。
10) チューブに蓋をした後、指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。
11) フェノール処理後、チューブを高速遠心機にかけ12000rpm、5分間遠心した。
12) 遠心後、チューブ内にはDNAを含む水層(上層)とフェノール層(下層)の二層に分かれた状態になった。
13) P-200を使って160μL に設定し、フェノール層をとらないように水層をとった。それぞれのチューブでチップは取り換えた。
14) フェノール層を取り除いたDNA溶液にp-1000を使ってクロロホルム250μL 加えた。
15) チューブに蓋をした後、指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。
16) 攪拌後、チューブを高速遠心機にかけ12000rpm、5分間遠心した。
17) 遠心後、チューブ内にはDNAを含む水層(上層)とクロロホルム層(下層)の二層に分かれた状態になった。
18) 新しいチューブを2本用意し、それぞれに(λ)、(P) の印を書いた。次に、p-200を使い、150μLに設定して注意深く上層のDNA溶液を採った。また、P-200を使って30μLの３M CH₃COONaをDNA溶液に加えた。
19) P-1000を使い、95%エタノールをそれぞれに600 mL加えた。チューブに蓋をした後、指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。それぞれのチューブを氷の上に立てて10分放置した。
20) チューブを手で握って氷結した試料を溶解させた後、高速遠心機にかけ12000rpm、10分間遠心した。遠心後、卵を割るようにしてチューブの蓋を開け、上清を完全に流して捨てた。
21) P-1000を使い、70%エタノールをそれぞれに500μL 加えた後、チューブを指に挟んで固定し反転させながら攪拌した。
22) チューブを高速遠心機にかけ12000rpm、10分間遠心した。上清を上記のようにして、完全に取り除いた後、沈殿(目に見えない)をチューブをペーパーにひっくり返して乾燥させた。乾燥後、p-200を使ってそれぞれのチューブに30μL のTEを加えた。
DNAの連結実験手順
1) マイクロチューブを1本チューブ立てにとった。
2) P-200を使って、H₂Oを23μLチューブに入れた。
3) HindⅢで消化したプラスミドpUC19とλファージDNAをP-20を使って、それぞれチップを変えながら10μL ずつチューブに入れた。
4) 連結酵素用10倍濃縮緩衝液を5μLチューブに加えた。
5) T4リガーゼをP-20を使って2μLチューブに加えた。
6) 4℃で一昼夜放置した。
大腸菌の形質転換手順
1)-80℃に凍結保存した50μLコンピテントセルを融解後、氷水中に置いた。
2)DNA溶液を2μL加え、0℃で5分間静置した。
3)静置後、直ちに42℃、45秒間熱処理した。
4)再び、0℃で1分放置した。
5)LB寒天培地にX-galを60μL、IPTGを30μL滴下した。
6)形質転換菌液を全量滴下し、プレート前面に広げ、37℃で一晩培養した。
7)出現した白色コロニーは、滅菌した爪楊枝等でアンピシリンを含むLB液体培地に接種した。
プラスミドの抽出実験手順
1)p-1000を用いてチューブに菌液を採った。軽く遠心した後、チューブの蓋を卵を割るようにして開け、上清をシャーレに流しだして捨てた。
2)p-200を用いて100µlのリゾチーム溶液を加えた後、チューブをミキサーにかけ菌体を混濁させた。
3)蓋を開け、チューブ立てに差し込んで室温に5分間放置した。
4)p-1000を用いて200µlのアルカリ-SDS溶液を加え、蓋をしたチューブを縦に持ち、ゆっくり5回反転させて液を混ぜた。そして、0℃5分間放置した。
5)p-200を用いて予め冷却しておいた酢酸カリウムをすばやく150µL加え蓋をした後、チューブを縦に持ち持った手を5回たたいて液を急激に攪拌させた。攪拌後チューブを氷中に5分間放置した。
6)チューブを遠心分離器にかけ、12000rpm、5分間遠心した。この間に新しいチューブを用意しておいた。
7)遠心後、p-200を用いて注意深く上清を採り、新しいチューブに移した。
8)p-1000を用いてフェノール・クロロホルムを300µl加えた。チューブを縦に持ち、反転させながら攪拌後、2分間遠心した。遠心後、p-200を使って上清を300µl注意深く新しいチューブに採った。
9)もう1回クロロホルムをp-1000を用いて300µl採り、5分間遠心後、上清を採った。
10)上清にp-1000を用いて95%エタノールを400µl加え、チューブを反転させて液を攪拌させた後、室温に2分間放置した。次に、チューブを12000rpm、10分間遠心してDNAをペレットにした。遠心後、卵を割るようにしてチューブの蓋を開け、エタノールをシャーレに流しだした。次に、p-1000を用いて70％エタノールをチューブに加え蓋をして上下反転させて攪拌した。上記のように遠心したのち、エタノールを流しだし、チューブをペーパータオルの上に逆さまにして５分間程放置した。その後、乾燥させ、p-200を使って20µlの脱イオン水を加え、プラスミドを溶解させた。
制限酵素消化実験手順
1) マイクロチューブをとり、チューブ立てに立てた。
2) P-200を用いてチューブにH₂Oを28µl分柱した。チップは換えた。
3) P-20を用いて、HindⅢ用10倍濃縮緩衝液を青丸チューブから5µl採りチューブに加えた。チップは換えた。
4) プラスミドDNAをp-20で15µl採りチューブに加え、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。チップは換えた。
5) 制限酵素HindⅢをp-20で2µl採りチューブに入れ、指で軽くはじいて溶液を攪拌した。液につけて入れた。チップは換えた。
6) チューブは37℃に設定されたドライブロックに突き刺し、10分加温した。
電気泳動実験手順
1) パラフィルム上にLoading Dyeをのせ、λファージ、pUC19、形質転換体それぞれのHindⅢ処理後DNAとピペットマンを用いて混合させた。
2) アガロースゲルをセットし、1)の液を入れた。
3) 100V定電圧、室温で泳動を行った。
4) 泳動後のアガロースゲルをエチジウムブロマイドに浸け、UVを当てバンドを確認した。
考察
左側が私の班の結果である。右の班と比べると結果が薄く、見えていない部分がある。このような結果になってしまった理由として、ピペットの動作不良による作業の遅さにより、液が漏れてしまったと考えられる。
出典
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